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Jun 01, 2023

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 502 (2023) Citare questo articolo

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La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso ha trasformato la nostra capacità di visualizzare e misurare quantitativamente i processi biologici rapidamente e per lunghi periodi di tempo. In questa recensione, discutiamo degli sviluppi attuali e futuri nella microscopia a fluorescenza a foglio luminoso che prevediamo amplierà ulteriormente le sue capacità. Ciò include schemi di imaging intelligenti e adattivi per superare i tradizionali compromessi dell'imaging, ad esempio risoluzione spaziotemporale, campo visivo e salute del campione. Nella microscopia intelligente, un microscopio deciderà autonomamente dove, quando, cosa e come acquisire l'immagine. Valutiamo ulteriormente come le tecniche di restauro dell'immagine forniscano strade per superare questi compromessi e come i microscopi a foglio luminoso "open top" possano consentire l'imaging multimodale con un rendimento elevato. Pertanto, prevediamo che in futuro la microscopia a foglio luminoso svolgerà un ruolo importante nell’imaging biomedico e clinico.

Negli ultimi decenni, i microscopi ci hanno fornito preziose informazioni su come i processi biologici sono organizzati nello spazio e nel tempo. Un'innovazione fondamentale è stata la marcatura selettiva di proteine ​​e lipidi con marcatori fluorescenti1,2, consentendo tecniche di microscopia a fluorescenza come la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (o microscopia a foglio luminoso in breve)3. La microscopia a foglio di luce ci consente di visualizzare, quantificare e tracciare dinamicamente i componenti strutturali in vivo4,5,6 e in vitro7,8,9. I fondamenti della microscopia a foglio luminoso sono trattati in diverse revisioni10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, ma in breve, si basa su una separazione ortogonale del percorso di illuminazione e rilevamento, consentendo una selezione selettiva illuminazione di un intero piano di imaging e rilevamento simultaneo a campo ampio (Fig. 1a).

a La microscopia tradizionale a foglio luminoso come la microscopia con illuminazione selettiva sul piano (SPIM) a tre obiettivi si basa su una disposizione ortogonale dell'illuminazione (blu; obiettivi di illuminazione IL1 e IL2) e rilevamento (verde; obiettivo di rilevamento DO). Ciò garantisce che la risoluzione assiale dell'imaging sia governata principalmente dallo spessore del foglio di luce (blu) consentendo l'imaging su campioni di grandi dimensioni con rilevamento ad ampio campo (verde) e un buon sezionamento ottico. Per acquisire un volume 3D, il campione viene scansionato lungo l'asse di rilevamento spostando il campione stesso o scansionando il foglio luminoso insieme all'obiettivo nel percorso di rilevamento. b – d I primi esempi di imaging con fogli luminosi includono l'imaging continuo a lungo termine dei processi di sviluppo negli embrioni di topo e pesce zebra e l'imaging di tessuto eliminato con risoluzione subcellulare. b Katie McDole et al.4 hanno caratterizzato i movimenti cellulari coinvolti nello sviluppo del topo dagli stadi iniziali di striatura (E6.5) a quelli somitici (E8.5) mediante l'imaging di un embrione di topo che esprime CAGTAG1 con un marcatore istonico (H2B-eGFP) per oltre 44 H. Barra della scala: 100 μm. c Proiezioni selezionate dall'imaging multi-vista5 (tre angoli) del sistema vascolare embrionale del pesce zebra in crescita etichettato con il marcatore vascolare fluorescente (Tg(kdrl:EGFP), ciano) e il marcatore dei globuli rossi (Tg(GATA1a:dsRed), magenta) , ripreso da 20 ore post-fecondazione (hpf) a 86 hpf. Barra della scala: 500 μm d Adam Glaser et al.37 hanno eseguito l'imaging su larga scala di una fetta espansa di rene di 3,2 cm × 2,1 cm e 1 mm di spessore. Le regioni di interesse ad alta risoluzione hanno rivelato la morfologia dei glomeruli (barra della scala: 40 μm), dei vasi (barra della scala: 80 μm) e dei tubuli (barra della scala: 50 μm). La maggiore risoluzione dovuta all'espansione è stata ulteriormente dimostrata con uno zoom multicanale del tessuto controcolorato con DAPI (barre della scala: 100 μm [in alto] e 20 μm [in basso]). Le barre della scala indicano quindi le dimensioni del tessuto nativo non espanso. Il pannello b è stato adattato con il permesso di Katie McDole et al. (2018)4. Pannello c adattato da Daetwyler et al. (2019)5. Pannello d adattato da Glaser et al. (2019)37.